HiPURE高純度質(zhì)粒小提試劑盒
產(chǎn)品及特點(diǎn)
本試劑盒用于高純度質(zhì)粒DNA的小量制備。菌體經(jīng)堿裂解、高鹽、低 pH 處理，質(zhì) 粒可從菌體中釋放出來(lái)，并特異、高效地被離心吸附柱吸附。通過(guò)清洗液的洗滌可去除 雜質(zhì)，在低鹽、高pH條件下洗脫，得到純度較高的質(zhì)粒 DNA 。使用本試劑盒每次 可處理 1-5 ml 過(guò)夜培養(yǎng)的菌液，所得質(zhì)粒可直接用于酶切、轉(zhuǎn)化、PCR 、測(cè)序及轉(zhuǎn)染等 各種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。
它具有下列特點(diǎn)：
1. 快捷、高效：操作簡(jiǎn)便，得率高，節(jié)約時(shí)間。
2. 純度高：沉淀致密，去雜干凈。
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Buffer BL
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25 ml
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50 ml
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100ml
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Buffer S1
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15ml
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30ml
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60ml
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Buffer S2
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15ml
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30ml
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60ml
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Buffer S3
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20ml
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40ml
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80ml
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Buffer W1（concentrate）
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13ml
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26ml
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52ml
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Buffer W2（concentrate）
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15ml
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30ml
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60ml
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Buffer EB
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10ml
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10 ml
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30ml
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RNase A (10 mg/ml)
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150μl
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300μl
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600μl
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Spin Column with Collection Tubes
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50套
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100套
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200套
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注意：使用前將全部 RNase A 溶液加到 Buffer S1 中混合均勻，2 - 8℃保存;按要求在 Buffer W1 和 W2 中加入無(wú)水乙醇
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本產(chǎn)品僅供科研使用，不得用于其它用途
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保存條件
在室溫(15-25℃)干燥條件下，可保存 12 個(gè)月；更長(zhǎng)時(shí)間的保存可置于 2-8℃ 。若溶 液產(chǎn)生沉淀，應(yīng)在使用前置于 37℃下溶解沉淀。加入 RNase A 后的 Buffer S1 應(yīng)置于 2-8℃ 保存，可穩(wěn)定保存 6 個(gè)月。
使用方法
柱平衡：
向吸附柱中（吸附柱放入收集管中）加入400μl 的平衡液BL ，12,000 rpm (-13,400×g ) 離 心 1 min ，棄收集管中濾液，將吸附柱重新放回收集管中。（請(qǐng)使用當(dāng)天處理過(guò)的柱子）
1. 取 1-5 ml 過(guò)夜培養(yǎng)的菌液，室溫 12,000 rpm 離心 1 min ，盡量將上清去除干凈。
（注 意：根據(jù)菌液的濃度決定取液量，濃度高時(shí)取 1.5 ml 菌液離心即可，濃度低時(shí)可多收集一次）
2. 加入 250 μl Buffer S1 ，旋渦震蕩或用移液器充分吹打使菌體重懸均勻。
（注 意：菌體沉淀一定要懸浮均勻，如有未徹底懸浮的菌塊會(huì)影響裂解，導(dǎo)致提取的質(zhì)粒濃度及純度降低）
3. 加入 250 μl Buffer S2 ，溫和顛倒混勻使菌體完全裂解，直到溶液變成清亮、粘稠。
（注 意：不可劇烈震蕩， 以免造成基因組DNA片段的污染，所用時(shí)間不要超過(guò)5 min ， 以免質(zhì)粒受到破壞，如未完全變得清亮，可能是菌體太多，可增加Buffer S2的用量，在后續(xù)的操作中 Buffer S3 的用量也要相應(yīng)增加）
4. 加入350μl Buffer S3 ，立即顛倒混勻6-8次，可見(jiàn)白色沉淀物產(chǎn)生，室溫靜置 2 min， 然后12,000 rpm 離心 5 min。
（注 意：Buffer S3 加入后應(yīng)立即混勻，避免產(chǎn)生局部沉淀）
5. 小心將上清液轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中，12,000 rpm 離心 0.5 min ，棄收集管中濾液。
6. 可選步驟：向吸附柱中加入 500 μl Buffer W1 ，12,000 rpm離心0.5 min ，棄收集管中濾液。
（注 意：Buffer W1 為濃縮液，按要求加入無(wú)水乙醇，用后應(yīng)立即蓋緊瓶蓋， 以防酒精揮發(fā)。如果宿主菌是endA- ，如DH5α或TOP10 ，此步驟可省略。如果宿主菌是 endA+ ，如 TG1 、BL21 、HB101、 JM101等，此步驟不可省略，因這些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解質(zhì)粒。如果提取低拷貝質(zhì)粒也 推薦采用此步驟）
7. 加入 600 μl Buffer W2 ，室溫 12,000 rpm 離心 0.5 min ，棄收集管中濾液。
（注 意：Buffer W2為濃縮液，按要求加入無(wú)水乙醇，用后應(yīng)立即蓋緊瓶蓋， 以防酒精揮發(fā)）
8. 加入 500 μl Buffer W2 ，室溫12,000 rpm 離心0.5 min ，棄收集管中濾液。
9. 干燥。將離心吸附柱于12,000 rpm 離心 2 min ，甩干殘留漂洗液。
（注 意：此步不能省略，否則殘留乙醇會(huì)影響質(zhì)粒的后續(xù)使用）
10. 將吸附柱置于一新的無(wú)菌 1.5 ml 離心管（自備）中，加入 50-100 μl 的洗脫液 Buffer EB， 室溫放置 2 min ，12,000 rpm 離心 1 min ，離心管底溶液即質(zhì)粒 DNA。
（注 意：為增加洗脫效率，可將洗脫液在60℃預(yù)熱。如需使用去離子水洗脫，可用NaOH 調(diào)整其pH值在 7.0 - 8.5之間，為了增加質(zhì)?；厥章?，可將得到的溶液重新加入到離心管中，室溫放置 2 min， 再次離心收集）
低拷貝或大質(zhì)粒（>10 kb）提取
如果所提質(zhì)粒為低拷貝質(zhì)?；虼笥?10 kb 的大質(zhì)粒，應(yīng)加大菌體使用量，使用 5-10 ml 過(guò)夜培養(yǎng)物，同時(shí)按照比例增加 Buffer S1 、S2 、S3 的用量，洗脫液 Buffer EB 應(yīng)在 60℃ 水浴預(yù)熱，在吸附和洗脫時(shí)可以適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間，以增加提取效率。其它步驟相同。
注意事項(xiàng)
1. 細(xì)-菌培養(yǎng)時(shí)間一般為12-16小時(shí)，如接種量大則應(yīng)減少培養(yǎng)時(shí)間，過(guò)度培養(yǎng)會(huì)降低質(zhì)粒質(zhì)量甚至導(dǎo)致質(zhì)粒DNA突變。
2. 每次使用時(shí)都要注意 Buffer S2 和 S3 是否形成沉淀，如有沉淀 37℃溶解后再用。
3. 注意Buffer S1，S2 和 S3的用量比例，若細(xì)-菌量增大，需按比例放大這些溶液使用量。
4. 質(zhì)粒的產(chǎn)量跟細(xì)-菌量、質(zhì)粒拷貝數(shù)、質(zhì)粒大小和操作規(guī)范程度密切相關(guān)，一般 1.5 ml 過(guò) 夜培養(yǎng)菌體可收獲約10 μg 高拷貝質(zhì)粒。
