產(chǎn)品詳情
簡單介紹：
通用型基因組DNA提取試劑盒本試劑盒適合于從新鮮或冷凍的動(dòng)物組織，細(xì)胞，血液，細(xì)-菌等多種樣品中提取高純度總 DNA。本品可純化獲得分子量大為 50kb 的 DNA 片段，純化過程不需要使用苯酚或氯仿等有毒溶劑，無需乙醇沉淀。本試劑盒采用優(yōu)化的緩沖體系使裂解液中的DNA高效特異的結(jié)合到硅基質(zhì)離心吸附柱上，PCR 和其他酶促反應(yīng)的抑制劑可通過兩步洗滌步驟被有效去除，使用低鹽緩沖液或水洗脫，即可得到高純度DNA。純化得到的DNA可以直接用于酶切，PCR，Real-Time PCR，文庫構(gòu)建，Southern Blot，
詳情介紹：
產(chǎn)品特點(diǎn)
本試劑盒適合于從新鮮或冷凍的動(dòng)物組織，細(xì)胞，血液，細(xì)-菌等多種樣品中提取高純度總 DNA。本品可純化獲得分子量大為 50kb 的 DNA 片段，純化過程不需要使用苯酚或氯仿等有毒溶劑，無需乙醇沉淀。本試劑盒采用優(yōu)化的緩沖體系使裂解液中的DNA高效特異的結(jié)合到硅基質(zhì)離心吸附柱上，PCR 和其他酶促反應(yīng)的抑制劑可通過兩步洗滌步驟被有效去除，使用低鹽緩沖液或水洗脫，即可得到高純度DNA。純化得到的DNA可以直接用于酶切，PCR，Real-Time PCR，文庫構(gòu)建，Southern Blot，
它具有下列特點(diǎn)：
它具有下列特點(diǎn)：
1. 簡便快速：1 小時(shí)內(nèi)可獲得高純度的基因組 DNA；
2. 質(zhì)量好：可直接進(jìn)行 PCR、酶切和雜交等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。
成分規(guī)格
|
Buffer GTL |
12ml |
25ml |
50ml |
|
Buffer GL |
12ml |
25ml |
50ml |
|
Buffer EB |
10ml |
10ml |
30ml |
|
Buffer W1（concentrate） |
13ml |
26ml |
52ml |
|
Buffer W2（concentrate） |
15ml |
30ml |
60ml |
|
Proteinase K |
1ml |
2×1ml |
4×1ml |
|
Spin Columnwith Collection Tubes |
50套 |
100套 |
200套 |
|
蛋白酶K 于-20℃, 其他組分室溫（15 - 25℃) , 可保存 12 個(gè)月 |
|||
|
本產(chǎn)品僅供科研使用，不得用于其它用途 |
|||
使用方法
自備試劑
無水乙醇
Enzymatic Lysis Buffer（提取革蘭氏陽性菌基因組DNA時(shí)須準(zhǔn)備）。EnzymaticLysisBuffer 配方：20 mM Tris，pH 8.0；2 mM Na2-EDTA；1.2％Triton X-100；終濃度為20mg/ml的 Lysozyme（溶菌酶）。
一、血液及細(xì)胞樣本基因組提取
1. 材料處理
1) 如果提取材料為哺乳動(dòng)物抗凝血液（無核紅細(xì)胞），可直接向50-200μl 新鮮或冷凍的抗凝血液樣品中加入 Buffer GTL 補(bǔ)足至 200μl。
2) 如果提取材料為禽類，鳥類，兩棲類或更低級(jí)生物的抗凝血液，其紅細(xì)胞為有核細(xì)胞，取 5-10μl 新鮮或冷凍的抗凝血液樣品，加入Buffer GTL 補(bǔ)足至200μl。
3) 貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞應(yīng)先處理為細(xì)胞懸液（提取量為5x106 個(gè)細(xì)胞），2000rpm（400g）離心 5min，棄盡上清，加 200μl GTL，振蕩至樣品徹底懸浮。
（注 意：如需去除 RNA，可在上述步驟完成后，加入 4μl 濃度為 100mg/ml 的RNase A溶液，渦旋15 秒，室溫放置 2min。）
2. 加入 20μl Proteinase K 溶液,混勻。
3. 加入 200μl Buffer GL，渦旋振蕩充分混勻，56?C 水浴 10min。
4. 短暫離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。加入200μl 無水乙醇，渦旋振蕩充分混勻，短暫離心。
（注 意：加入 Buffer GL 和無水乙醇后要立即渦旋震蕩混勻。加入 Buffer GL 和無水乙醇后可能會(huì)產(chǎn)生白色沉淀，不會(huì)影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。一些組織在加入 Buffer GL 和無水乙醇后可能形成溶膠狀產(chǎn)物，此時(shí)推薦進(jìn)行劇烈震蕩或渦旋處理。）
5. 上一個(gè)步驟中所得溶液全部加入到已裝入收集管的吸附柱（Spin Columns DM）中，若一次不能加完溶液，可分多次轉(zhuǎn)入。12,000 rpm（約 13,400g）離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
6. 向吸附柱中加入 500μl Buffer W1（使用前檢查是否已加入無水乙醇），12,000rpm離心 1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
7. 向吸附柱中加入 500μl Buffer W2（使用前檢查是否已加入無水乙醇），12,000rpm離心 1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
（注 意：如需進(jìn)一步提高 DNA 純度，可重復(fù)步驟 7。）
8. 12,000 rpm 離心 2min，倒掉收集管中廢液。將吸附柱置于室溫?cái)?shù)分鐘，以徹底晾干。（注 意：這一步的目的是將吸附柱中殘余的乙醇去除，乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù)的酶切、PCR等酶促反應(yīng)）。
9. 將吸附柱置于一個(gè)新的離心管（自備）中，向吸附柱的中間部位懸空加入50-200μlBuffer EB 或滅-菌水，室溫放置 2-5min，12000rpm離心1min，收集DNA溶液，-20℃保存 DNA。
（注 意：為增加洗脫效率，可將洗脫液 Buffer EB 在 60℃預(yù)熱。如需使用去離子水洗脫，可用NaOH調(diào)整其pH值在7.0 - 8.5之間，為了增加回收率，可將得到的溶液重新加入到吸附柱中，室溫放置2min，再次離心收集）
二、動(dòng)物組織基因組提取
1. 材料處理如果提取材料為動(dòng)物組織，取 25 mg（脾組織用量應(yīng)少于10 mg）；如果材料為鼠尾，取一段長度為 0.4-0.6 cm 的大鼠鼠尾或兩段長度為 0.4-0.6 cm 的小鼠鼠尾。樣本進(jìn)行液氮研磨或切成小塊后置于 1.5 ml 離心管中，加入 180μl Buffer GTL，將不同樣品做好標(biāo)記。若使用勻漿器處理樣本，勻漿前向樣本中加入不超過 80μl Buffer GTL，勻漿后加入100μlBuffer GTL。
注 意：
1）確保各組織的量不要超出推薦范圍。
2）組織樣本在加入 Buffer GTL 之前用液氮研磨或加入 Buffer GTL 用勻漿器勻漿處理，可以增加裂解效率。）
2. 加入 20μl Proteinase K，渦旋震蕩使樣品徹底混勻。56℃水浴，直至組織完全裂解，孵育過程中可每隔一段時(shí)間顛倒或震蕩離心管使樣品分散。
注 意：
1）不同組織消化時(shí)間不同，通常 1-3 小時(shí)即可完成，鼠尾需要消化6-8 小時(shí)，必要時(shí)過夜消化，不會(huì)影響后續(xù)操作。
2）如果孵育和渦旋震蕩后仍然有膠狀物質(zhì)，延長56?C 孵育時(shí)間或再加入20μl Proteinase K 消化。
3）如需去除 RNA，可在上述步驟完成后，加入4μl 的濃度為100mg/ml 的RNase A 溶液，渦旋 15 秒，室溫放置 5-10min。）
3. 加入 200μl Buffer GL，渦旋震蕩充分混勻，70?C 水浴 10min。短暫離心后加入200μl無水乙醇，渦旋震蕩充分混勻。
注 意：
1）加入 Buffer GL 和無水乙醇后要立即渦旋震蕩混勻。
2）加入 Buffer GL 和無水乙醇后可能會(huì)產(chǎn)生白色沉淀，不會(huì)影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。一些組織（如脾，肺）在加入 Buffer GL 和無水乙醇后可能形成溶膠狀產(chǎn)物，此時(shí)推薦進(jìn)行劇烈震蕩或渦旋處理。）
4. 短暫離心，將步驟 3 所得溶液全部加入到已裝入收集管的吸附柱（Spin Columns DM）中，若一次不能加完溶液，可分多次轉(zhuǎn)入。12,000 rpm（約13,400g）離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
5. 向吸附柱中加入 500μl Buffer W1（使用前檢查是否已加入無水乙醇），12,000rpm離心 1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
6. 向吸附柱中加入 500μl Buffer W2（使用前檢查是否已加入無水乙醇），12,000rpm。離心 1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
（注 意：如需進(jìn)一步提高 DNA 純度，可重復(fù)步驟）
7. 12,000 rpm 離心 2min，倒掉收集管中廢液。將吸附柱置于室溫?cái)?shù)分鐘，以徹底晾干。（注 意：這一步的目的是將吸附柱中殘余的乙醇去除，乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù)的酶切，PCR等酶促反應(yīng)）。
8. 將吸附柱置于一個(gè)新的離心管（自備）中，向吸附柱的中間部位懸空加入50-200μlBuffer EB 或滅-菌水，室溫放置 2-5min，12,000 rpm離心1min，收集DNA溶液，-20℃保存 DNA。
（注 意：為增加洗脫效率，可將洗脫液 Buffer EB 在 60℃預(yù)熱。如需使用去離子水洗脫，可用NaOH調(diào)整其pH值在7.0 - 8.5之間，為了增加回收率，可將得到的溶液重新加入到吸附柱中，室溫放置2min，再次離心收集）
三、細(xì)-菌基因組提取
1. 細(xì)-菌樣本預(yù)處理取 1 - 3 ml 過夜培養(yǎng)的菌液，室溫 10,000 rpm 離心 1 min，棄上清。（注 意：根據(jù)菌液的濃度決定取液量，當(dāng) OD600=1 時(shí)，1ml 菌液濃度為 109 個(gè)細(xì)胞，菌液的量不要超過 109 個(gè)細(xì)胞，太多會(huì)使離心柱的膜堵塞，提取的基因組 DNA 的量減少，純度降低）
2. 加入 200μl Buffer GTL，用槍頭充分吹打或用渦旋振蕩器充分懸浮。
（注 意：對(duì)于較難破壁的革蘭氏陽性菌，可略過第 2 步驟，加入溶菌酶進(jìn)行破壁處理，具體方法為：加入 180 μl 終濃度為 20 mg/ml 的溶菌酶緩沖液(20 mM Tris, pH 8.0；2 mM Na2-EDTA；1.2%TritonX-100；溶菌酶必須用溶菌酶干粉溶解在緩沖液中進(jìn)行配制，否則會(huì)導(dǎo)致溶菌酶無活性)，37 ℃處理30 min 以上。如要去除 RNA，可加入濃度為 100 mg/ml 的 RNase A 4μl，室溫處理5 min）
3. 加入 20μl Proteinase K 溶液，充分混勻。
4. 加入 200μl Buffer GL，充分混勻，56℃水浴 10 min，孵育過程中每隔一段時(shí)間顛倒或震蕩離心管使樣本分散均勻。溶液變得清亮后短暫離心，以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。（注意：Buffer GL 加入時(shí)可能會(huì)產(chǎn)生白色沉淀，一般 56℃時(shí)會(huì)消失，不影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)，如溶液未變清亮，說明細(xì)胞裂解不徹底，可能導(dǎo)致提取的 DNA 量少或者提取的 DNA 不純
5. 加入 200μl 無水乙醇，充分震蕩，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀，短暫離心以去除管蓋內(nèi)壁水珠。
6. 將一個(gè)離心吸附柱放入收集管中，將上一步所得溶液和絮狀沉淀轉(zhuǎn)移到吸附柱中，12,000 rpm 離心 1 min，棄收集管中的濾液。
7. 向吸附柱中加入 500μl Buffer W1（使用前檢查是否已加入無水乙醇），12,000rpm離心 1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
8. 向吸附柱中加入 500μl Buffer W2（使用前檢查是否已加入無水乙醇），12,000rpm。離心 1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。（注意：如需進(jìn)一步提高 DNA 純度，可重復(fù)步驟 6。）
9. 12,000 rpm 離心 2min，倒掉收集管中廢液。將吸附柱置于室溫?cái)?shù)分鐘，以徹底晾干。（注 意：這一步的目的是將吸附柱中殘余的乙醇去除，乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù)的酶切、PCR等酶促反應(yīng)）。
10. 將離心吸附柱置于一個(gè)新的 1.5 ml 塑料離心管（自備）中，加入50 - 100μl Buffer GE，室溫放置 2 min，12,000 rpm 離心 1 min，離心管底溶液即基因組DNA。
（注 意：為增加洗脫效率，可將洗脫液 Buffer EB 在 60℃預(yù)熱。如需使用去離子水洗脫，可用NaOH 調(diào)整其pH值在7.0 - 8.5 之間，為了增加回收率，可將得到的溶液重新加入到吸附柱中，室溫放置 2 min，再次離心收集）
注意事項(xiàng)
1. 如 Buffer GTL 和 Buffer GL 產(chǎn)生沉淀，可在 56℃水浴溶解。
2. 樣品應(yīng)避免反復(fù)凍融，否則會(huì)導(dǎo)致提取的 DNA 片段小，提取量下降。
3. 所有離心步驟均為臺(tái)式離心機(jī)，室溫下操作。
4. 按要求在 Buffer W1 和 Buffer W2 中加入無水乙醇。
