產(chǎn)品特點(diǎn)
本試劑盒是基于 T7 RNA 聚合酶的 RNA 體外轉(zhuǎn)錄試劑盒，它利用含有T7 啟動(dòng)子的模版 DNA，以 NTP 為底物，從 T7 啟動(dòng)子下游開(kāi)始合成與模版DNA 中一條鏈互補(bǔ)的RNA，簡(jiǎn)單快速獲得大量的 RNA 分子。
它具有下列特點(diǎn)：
1. 即開(kāi)即用，用戶(hù)只需提供含 T7 啟動(dòng)子的 DNA 模板即可以進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)不需要單獨(dú)準(zhǔn)備每一個(gè)成份。
2. 單溶液預(yù)配液，減少加樣次數(shù)，避免了操作誤差，增加了可重復(fù)性。
3. 模版 DNA 可以是線性化的質(zhì)粒 DNA，也可以是 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物。
4. 可以合成的 RNA 的佳長(zhǎng)度在 20nt 到 2000nt 之間。
5. 產(chǎn)品配方經(jīng)過(guò)精心優(yōu)化，每 1μg DNA 模版可以合成2～6μg RNA。
6. 得到的 RNA 可以用于 RNA 結(jié)構(gòu)研究、核酶生物化學(xué)、體外翻譯、RNA蛋白質(zhì)相互作用、反義技術(shù)、SELEX 技術(shù)和 RNA 干擾（RNAi）等實(shí)驗(yàn)。
7. 本試劑盒足夠 50 次 20μL 體系的體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)并且只能用于科研。。
成分規(guī)格
產(chǎn)品組成
T7 轉(zhuǎn)錄預(yù)配液 2× 0.5 mL
RNase-free 水 水 1mL
保存條件
-20℃可保存 12 個(gè)月
自備試劑
Tris 飽和酚、氯仿、RNase-free 75%乙醇。
制備 DNA 模板
（本試劑盒不含所需試劑，此處信息僅供參考）PCR 片段和質(zhì)粒 DNA 都可以用作體外轉(zhuǎn)錄的模板，但是必須注意以下幾點(diǎn)。
a)必須使用線性化的 DNA。如果是質(zhì)粒 DNA，則必須先用適當(dāng)?shù)南拗菩詢(xún)?nèi)切酶切成線狀。
b) 需要轉(zhuǎn)錄的 DNA 序列的上游必須有 T7 啟動(dòng)子。如果模板是PCR產(chǎn)物，則可以在設(shè)計(jì)引物時(shí)將 T7 啟動(dòng)子序列 5′TAA TAC GAC TC A CTA TAGGG3′加上。如果是將 DNA 片段克隆到載體上，則需要選擇有 T7 啟動(dòng)子的載體，并且克隆位點(diǎn)必須位于 T7 啟動(dòng)子下游。
c) 需要轉(zhuǎn)錄的 DNA 序列的下游端不要是 3′突出。如果是3′突出（比如選擇了 Pst I 來(lái)線性化質(zhì)粒），則用 T4 DNA 聚合酶修平。
d) 必須保證 DNA 模板中沒(méi)有 RNase。由于提取質(zhì)粒 DNA 的過(guò)程中一般要使用大量的 RNase A，因此質(zhì)粒 DNA 一般都有嚴(yán)重的 RNase A 污染，所以在用作模板前，采取膠回收的方法純化質(zhì)粒 DNA。并且加入少量總RNA 一起保溫然后電泳檢測(cè) RNA 是否被降解，以此來(lái)判斷純化的 DNA 模板是否有殘留RNase A。如果有 RNase 污染，則必須反復(fù)酚氯仿抽提去除殘留的RNase 然后再乙醇沉淀質(zhì)粒DNA。
體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
1. 如果有 N 個(gè)樣品，強(qiáng)烈建議做一個(gè)陰性對(duì)照，故共設(shè)置N+1 個(gè)反應(yīng)，這樣一起并排電泳時(shí)容易判斷哪個(gè)條帶是模板 DNA，哪個(gè)條帶是轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增得到的RNA。在N+1 個(gè) RNase-free 的塑料離心管中，在室溫下（不是在4℃下）按次序加入下列成分，T7 轉(zhuǎn)錄預(yù)配液容易產(chǎn)生結(jié)晶，沉淀一定要握在手中直到結(jié)晶徹底溶解并搖勻后方可使用。
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成分
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N 個(gè)樣品管
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陰性對(duì)照管
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DNA 模板
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100-500ng左右的PCR片段或線狀質(zhì)粒
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－
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2×T7 轉(zhuǎn)錄預(yù)配液
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各10μL
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10μL
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RNase-free 水
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至20μL
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至20μL
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注：此為 20μL 反應(yīng)體系的用量，對(duì)其他反應(yīng)體系，各成分的用量可以按比例增減。本產(chǎn)品的2×T7轉(zhuǎn)錄預(yù)配液已經(jīng)含有 NTP。如果需要標(biāo)記 RNA 探針或制備帶帽 RNA，則需要訂購(gòu)NTP 分開(kāi)的試劑盒。
2.37℃保溫 1-2 小時(shí)(注意：延長(zhǎng)保溫時(shí)間并不能大幅提高產(chǎn)量。
3. 加入 2μL 自備的 500mM 的 EDTA 溶液滅活 T7 RNA 聚合酶。
4. 取 5μL 電泳，此時(shí)加上一個(gè) DNA 模板做電泳對(duì)照。電泳時(shí)比陰性對(duì)照多出的條帶就是轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增得到的 RNA，由于合成的 RNA 長(zhǎng)度不均勻，即使長(zhǎng)度均勻，但由于自身形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，泳動(dòng)速度也不一致，所以電泳所得RNA條帶一般都不是清晰單一條帶，而是比較彌散的電泳條帶。但由于RNA 是單鏈，分子量比同樣長(zhǎng)度的 DNA 小一倍，因此 RNA 一般比其雙鏈 DNA 模板電泳速度更快。
5. 定量，可以用自備的單鏈 RNA 定量試劑盒檢測(cè)濃度。不推薦使用電泳定量。使用本試劑盒時(shí) 1μg 的 DNA 模板一般可以合成 2～6μg 的RNA。
6. 得到的 RNA 可以放 80℃保存。如需去除 DNA 模板，請(qǐng)按下面步驟操作。
去除 DNA 模板（所需試劑需要另購(gòu)）
1. 在 20μL 體積的體外轉(zhuǎn)錄體系中加入 2μL 的 10×DNase Buffer 和1μL自備的RNase-free DNase 3～5U/μL。
2. 37℃保溫 30 分鐘。
3. 補(bǔ) RNase-free 水到 100μL。增加體積可以減少樣品的丟失。
4. 用自備的等體積 100μL 的 Tris 飽和酚和氯仿震蕩混勻后14000g 離心3 分鐘將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中。此步去除 DNase 和 RNA 聚合酶。
5. 加自備的 200μL 無(wú)水乙醇和 10μL 3M 的乙酸鈉溶液（pH5.2），振蕩后14000rpm離心 20 分鐘，RNA 形成沉淀，棄上清。
6. 在沉淀中加入 1mL 75%乙醇，震蕩 10 秒后 14000g 離心5 分鐘，棄上清。
7. 短暫離心數(shù)秒，用槍頭吸棄上清。不要丟失沉淀。
8. 晾干，所得沉淀即體外轉(zhuǎn)錄所得的 RNA。去除 DNA 模板也可以用 PCR 產(chǎn)物純化回收試劑盒。
問(wèn)題解答
1. 沒(méi)有RNA產(chǎn)物。常見(jiàn)原因是模板有RNase污染，可用純化好的RNA跟模板DNA一起保溫再電泳，再檢測(cè)其是否有污染。
2. RNA產(chǎn)量低。常見(jiàn)的原因是DNA模板。在轉(zhuǎn)錄序列的一個(gè)和二個(gè)堿基都是G，在前14個(gè)堿基內(nèi)避免有U存在。
3. RNA長(zhǎng)度比預(yù)期的短?？赡苁悄０逍蛄兄杏蠺7 RNA聚合酶的終止序列。
4. RNA長(zhǎng)度比預(yù)計(jì)的長(zhǎng)。T7 RNA聚合酶跟Taq DNA聚合酶一樣，有不依賴(lài)于模板的加尾功能，有一半的RNA可以帶一個(gè)或兩個(gè)堿基的尾巴。如果RNA長(zhǎng)度比預(yù)計(jì)的長(zhǎng)很多，使用的模板又是質(zhì)粒DNA，則可能是質(zhì)粒線性化不徹底。
5. 5′單磷酸還是三磷酸?如果使用GTP，則得到的RNA是三磷酸，體外轉(zhuǎn)錄時(shí)如果保溫時(shí)間太長(zhǎng)（如12小時(shí)），則有50%的三磷酸會(huì)變成單磷酸。如果在轉(zhuǎn)錄體系中加入GMP，則T7 RNA聚合酶將優(yōu)先使用GMP，所得RNA產(chǎn)物中5'端是單磷酸的比例將大大增加。6. 用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒如何得到帶帽RNA?需加入帶帽NTP類(lèi)似物即可。
