上海通蔚：探討ELISA試劑盒靈敏度偏低、重復(fù)性較差的問題

ELISA試劑盒的使用非常便捷這是眾所公認(rèn)的，但同時也有一些特殊因素時刻影響試驗的正常結(jié)果。較為常出現(xiàn)的問題是顯色淡，靈敏度偏低、重復(fù)性不佳、假陽性結(jié)果和假陰性結(jié)果。

一、顯色淡，靈敏度偏低
1.試劑盒在運輸途中時間太長，溫度太高；所以盡量縮短運輸時間，夏季應(yīng)放冰塊降溫。
2.培養(yǎng)箱溫度不足37℃，應(yīng)注意培養(yǎng)箱溫度，放入反應(yīng)板后盡量減少開啟次數(shù)以免影響溫度恒定，非隔水式培養(yǎng)箱尤其應(yīng)注意。
3.試劑盒未充分平衡；所以試劑盒從2～8℃冰箱取出后打開盒蓋，于室溫平衡至少20分鐘，確保所有試劑已平衡至室溫（約25℃）。
4.保溫時間不足；所以做實驗時一定注意時間的重要性，如果怕忘了時間，可以校正定時鐘準(zhǔn)確定時。
5.洗滌時沖擊力太大、浸泡時間過長、洗滌次數(shù)增加；按說明書要求保留洗滌時間，準(zhǔn)確記住洗滌次數(shù)。
6.移液器吸液量不足，吸嘴內(nèi)壁掛水太多或內(nèi)壁不清潔；所以保證校正移液器，吸嘴要配套，裝吸嘴時要緊密，吸嘴內(nèi)壁要清潔，一次性使用。
7.蒸餾水水質(zhì)有問題，要使用新鮮合格的蒸餾水。

二、假陽性結(jié)果和假陰性結(jié)果
1、標(biāo)本的采集與保存
1)當(dāng)標(biāo)本采集保存不當(dāng)產(chǎn)生溶血時，紅細(xì)胞中的血紅蛋白釋放到血清中，血紅蛋白具有過氧化物酶的性質(zhì)，其通過吸附或“PP效應(yīng)”（蛋白質(zhì)間相互吸附的現(xiàn)象）結(jié)合后，可催化A、B液顯色而造成假陽性
2)反復(fù)凍融血清會使抗體效價跌落，所以測抗體的血清標(biāo)本如需保存做多次檢測，宜少量分裝凍存。
3)標(biāo)本采集保存不當(dāng)致污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，會產(chǎn)生假陽性反應(yīng)；標(biāo)本在冰箱中保存時間過長導(dǎo)致血清IgG聚合，易使間接法的試驗本底加深。因此，標(biāo)本宜在新鮮時檢測。

2.加樣
1)如果樣品稀釋液少加或血清多加，都會引起本底增高。對于間接法來說，受上述兩個因素影響更大。因為血清中受檢的特異性IgG只占IgG中的一小部分。IgG的吸附性很強，非特異性IgG可直接吸附到固相載體上，有時也可吸附到包被抗原的表面。這些非特異性的IgG均可以和酶標(biāo)二抗發(fā)生反應(yīng)而造成較高陰性本底或假陽性。如果加入的血清過多，高于規(guī)定的稀釋倍數(shù)，極易造成高值陰性。反之，造成假陰性。
2)如果加入的酶結(jié)合物過多或加在較高的孔壁上或孔口，也會引起本底升高或假陽性。
3)如果血液未開始凝固或凝固不完全時就強行離心分離血清，此時的血清中仍留部分纖維蛋白原，在ELISA測定過程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊，易造成假陽性結(jié)果。

3.溫育
1)由于ELISA試驗在一定溫度下的反應(yīng)時間并不是反應(yīng)的終點，溫育時間過短、溫度過低，易致顯色不全；溫育時間過長、溫度過高，易致非特異性結(jié)合緊附于反應(yīng)孔周圍，難以清洗徹底，產(chǎn)生陰性高值或假陽性反應(yīng)。因此，要嚴(yán)格按規(guī)定的溫度和溫育時間進(jìn)行。
2)由于水浴較難將溫度控制在穩(wěn)定的范圍，因此我們每次試驗時應(yīng)認(rèn)真觀察水浴箱的溫度，盡量少開啟水浴箱門，嚴(yán)格控制水浴的溫度為37±0.5。同時，微孔板不可重疊放置，以保證傳熱均勻，各板的溫度都能迅速達(dá)到平衡。
3)由于試劑盒通常設(shè)定的反應(yīng)溫度為37度，在這個溫度下溫育一定時間，蒸發(fā)的水分會很多，對于整個反應(yīng)體系來講，各種反應(yīng)物的濃度會不斷地增加，這樣必會導(dǎo)致反應(yīng)*后的值升高。因此溫育時應(yīng)貼上封板膠。

4.洗板
洗板在ELISA過程中雖不是一個反應(yīng)步驟，但卻是決定試驗成敗的關(guān)鍵。ELISA就是靠洗板來達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的，通過洗板以清理殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗板時應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來。在ELISA操作中，洗滌是*主要的關(guān)鍵技術(shù)，應(yīng)嚴(yán)格按要求洗滌。洗板如不徹底，有酶結(jié)合物的非特異性吸附，將使空白值升高。另外，在間接法中如血清標(biāo)本內(nèi)的非特異性IgG吸附在固相上而未被洗凈，也將與酶標(biāo)記抗體作用而產(chǎn)生干擾。
1)各廠家的洗液是根據(jù)各自試劑的條件配制的，因此采用不配套的洗液常會得到不正常的反應(yīng)結(jié)果，包括本底升高，所以不同廠家的洗液不應(yīng)混用。
2)洗液應(yīng)按規(guī)定的倍數(shù)稀釋使用。試劑盒提供的洗液是濃縮的，過多稀釋洗液，會影響洗液的效果，而使反應(yīng)的本底升高。反之造成假陰性。
3)稀釋洗液的水應(yīng)該是新鮮的蒸餾水，電導(dǎo)率小于1.5us/cm。如果水中含有過多的鈣、鎂離子，這些離子會占用表面活性劑，使試驗本底增高。

三、重復(fù)性較差，經(jīng)常有客戶反饋說做了兩個復(fù)孔值相差太大?？赡艿膯栴}有：
1.保溫時間不一致，洗滌條件不一致，操作人員不一致；重復(fù)測定標(biāo)本，操作條件、人員等應(yīng)盡可能與上次保持一致，以排除這些因素造成的不一致的可能性。
2.樣品數(shù)量多少不一，加樣時間有長有短；所以重復(fù)某一樣品時，加樣時間盡可能接近。
3.加樣量不一致；樣品稀釋前應(yīng)充分混勻，盡可能使用同一移液器并裝緊吸嘴。