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檢測(cè)未知抗體的間接法

日期：2024-12-22 08:45
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摘要：用于檢測(cè)未知抗體的間接法：　　　 1、用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃過(guò)夜。 2、次日洗滌3次。加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體）0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37℃孵育1小時(shí),洗滌。同時(shí)做空白、陰性及陽(yáng)性孔對(duì)照于反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體（抗抗體）0.1ml，37℃孵育30-60分鐘，洗滌,*后一遍用DDW（超純水）洗滌。其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、5、6。 3. 加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分鐘。 4. 終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。 5. 結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽(yáng)性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無(wú)色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號(hào)表示。也可測(cè)OD值：在ELISA檢測(cè)儀上，于450nm（若以ABTS顯色，則410nm）處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽(yáng)性。

ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對(duì)底物的高效催化作用相結(jié)合起來(lái)的一種敏感性很高的試驗(yàn)技術(shù)。由于抗原、抗體的反應(yīng)在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進(jìn)行，每加入一種試劑孵育后，可通過(guò)洗滌除去多余的游離反應(yīng)物，從而保證試驗(yàn)結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性。比較常用的是ELISA雙抗體夾心法及ELISA間接法。以下詳細(xì)介紹未知抗體的間接法。

用于檢測(cè)未知抗體的間接法：　　　

1、用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃過(guò)夜。

2、次日洗滌3次。加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體）0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37℃孵育1小時(shí),洗滌。同時(shí)做空白、陰性及陽(yáng)性孔對(duì)照于反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體（抗抗體）0.1ml，37℃孵育30-60分鐘，洗滌,*后一遍用DDW（超純水）洗滌。其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、5、6。

3. 加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分鐘。

4. 終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。

5. 結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽(yáng)性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無(wú)色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號(hào)表示。也可測(cè)OD值：在ELISA檢測(cè)儀上，于450nm（若以ABTS顯色，則410nm）處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽(yáng)性。