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產(chǎn)品詳情

  • 產(chǎn)品名稱： 一步法RT-PCR擴增試劑盒

  • 產(chǎn)品型號： 100次×20ul
  • 產(chǎn)品廠商：通蔚生物
  • 產(chǎn)品價格：2070
  • 產(chǎn)品庫存：126
  • 產(chǎn)品文檔：
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簡單介紹：
一步法RT-PCR擴增試劑盒本試劑盒是專為一步法 RT-PCR 實驗研制，逆轉錄和 PCR 在同一反應體系中進行，反應過程中無需添加試劑，無需打開管蓋，在避免污染的同時提高了檢測靈敏度和實驗效率。本試劑盒包括全新高效逆轉錄酶、快速熱啟動 DNA 聚合酶，同時包含適用于逆轉錄和 PCR 擴增的反應緩沖液和實驗中所必需的其它組分。
詳情介紹：

產(chǎn)品特點
本試劑盒是專為一步法 RT-PCR 實驗研制，逆轉錄和 PCR 在同一反應體系中進行，反應過程中無需添加試劑，無需打開管蓋，在避免污染的同時提高了檢測靈敏度和實驗效率。本試劑盒包括全新高效逆轉錄酶、快速熱啟動 DNA 聚合酶，同時包含適用于逆轉錄和 PCR 擴增的反應緩沖液和實驗中所必需的其它組分。

SuperRT 逆轉錄酶RNaseH活性缺失，減少了逆轉錄反應中 RNA 的降解。該逆轉錄酶逆轉錄效率高，可對少量RNA模板進行良好的逆轉錄反應。PCR 反應使用的快速熱啟動 DNA 聚合酶具有擴增效率高、特異性強、延伸速度快的優(yōu)良性能。獨特的緩沖體系使逆轉錄酶和聚合酶同時發(fā)揮大功效。使用本試劑盒擴增得到的目的產(chǎn)物 3′端附有一個″A″堿基，可直接用于T/A克隆。

保存條件
長期保存，請置于-20℃，有效期 12 個月。使用后請及時放入-20℃保存以保證酶的活性。

使用方法
1. 將 RNA 模板、引物、2×OneStep RT-PCR Mix 和 RNase-Free Water 溶解　并置于冰上備用。
2. 按下表加入試劑，至終體積 20 μl：

試劑

20μl反應體系

終濃度

2×OneStep RT-PCR Mix

10μl

1×

Forward Primer，10 μM

0.5μl

0.25μM

Reverse Primer，10 μM

0.5μl

0.25μM

RNA Template

Xμl

1pg -1μg

RNase-Free Water

up to 20μl

／


注 意：
引物濃度請以終濃度 0.1-1.0μM作為設定范圍的參考。擴增效率不高的情況下，可提高引物的濃度；發(fā)生非特異性反應時，可降低引物濃度，由此優(yōu)化反應體系。
3. 渦旋震蕩混勻，短暫離心，將溶液收集到管底。
4. 設置反應程序，將 PCR 管置于熱循環(huán)儀中，進行 RT-PCR 反應。

反應條件：

過程

溫度

時間

反轉錄

50℃

5-30min

PCR預變性

95℃

2min

30－40cycles

變性

95℃

30sec

退火

55-65℃

30sec

延伸

72℃

1kb/30sec

終延伸

72℃

5min

注 意：
A. 一般 PCR 實驗中退火溫度比擴增引物的熔解溫度 Tm 低 5℃，退火時間一般為20-30 秒，無法得到理想的擴增效率時，適當降低退火溫度；發(fā)生非特異性反應時，提高退火溫度，由此優(yōu)化反應條件。
B. 延伸時間根據(jù)擴增的片段大小設定，本產(chǎn)品中包含的 DNA Polymerase擴增效率為1 kb/30s。
C. 可根據(jù)擴增產(chǎn)物的下游應用設定循環(huán)數(shù)。循環(huán)次數(shù)太少，擴增量不足；循環(huán)次數(shù)多，錯配機率會增加，非特異性背景嚴重。所以，在保證產(chǎn)物得率的前提下，應盡量減少循環(huán)次數(shù))
5. 反應結束后取 5 μl 反應產(chǎn)物，加入適量上樣緩沖液后進行電泳檢測結果。

注意事項
1. 在操作過程中應避免 RNase 污染，防止 RNA 降解或實驗中的交叉污染，建議在專門的區(qū)域進行 RNA 操作，使用專門的儀器和耗材，操作人員帶口罩和一次性手套并經(jīng)常更換手套。
2. 實驗盡量使用一次性塑料器皿，若使用玻璃器皿，應使用 0.1％DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在 37℃處理 12 小時，并在 120℃下高壓滅-菌 30 分鐘后使用，或者將玻璃器皿在180℃下干熱滅-菌 60 分鐘后使用。實驗中用到的無菌水應使用0.1%的DEPC處理后進行高壓滅-菌。
3.本試劑使用前請上下顛倒輕輕混勻，盡量避免起泡，并經(jīng)短暫離心后使用。使用后應盡快放回-20℃，避免反復凍融。
4.本試劑盒必須使用特異性引物，引物的選擇可根據(jù)具體實驗來選擇，引物設計的好壞直接影響到 RT-PCR 反應的結果，設計引物時需考慮 GC 含量，引物長度，引物位置，PCR產(chǎn)物的二級結構等因素，建議采用專業(yè)的引物設計軟件來設計。
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